Molte tecniche sono state usate per studiare la frammentazione del DNA nello sperma, tra cui la TUNEL (Terminal deoxynucleotidildyl transferase (TdT)-mediated dUTP Nick end Labelling, Lopes et al., 1998, Muratori et al. 2000), gel di elettroforesi su singola cellula (comet assay, Irvine et al., 2004), e SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay, Evenson et al., 2002).  Data la facilità e la rapiditàdi esecuzione, il TUNEL è uno dei metodi più comunemente usato per lo studio della frammentazione del DNA sullo sperma. Nelle cellule somatiche, il TUNEL è considerato specifico per l’apoptosi (Gold et al.,1994, Fraga et al., 1996). Infatti, è stato riportato che il templato e il primer TdT- indipendente è selettivo per visualizzare la degradazione del DNA di cellule apoptotiche, dal momento che il templato e il primer dipendente dalla DNA polimerasi preferenzialmente si lega alle rotture del DNA con altre origini, tra cui necrosi e irradiazioni. Questa differenza è spiegata dal fatto che il templato della DNA polimerasi e il primer TdT indipendente è in grado di legare i frammenti sia a singolo che a doppio filamento al terminale 3′, mentre il templato DNA polimerasi e il primer dipendente si lega solo a frammenti a singolo filamento (Manicardi et al., 1998). Così, TdT è utile per detectare le rotture del DNA sul doppio filamento che avvengono durante l’apoptosi. Lo studio della frammentazione del DNA negli spermatozoi con entrambi i tipi di analisi (usando i templati, polimerasi primer dipendente e templati e TdT primer indipendente) non si notano differenze nei risultati. Questo risultato può essere spiegato considerando la differenza di impacchettamento della cromatina tra l’uso di istoni e l’uso di protamine, dimostrando che la positività al TUNEL negli spermatozoi può non essere considerato, da solo, un indice di apoptosi e che c’è la possibilità che intervengano altri meccanismi per spiegare la rottura del DNA mostrata dalla TUNEL (Baccetti et al., 1996, Gandini et al., 2000). Daltrocanto, benchè altri fenomeni simili all’apoptosi sono stati scoperti nello sperma, una chiara dimostrazione di un’associazione tra la frammentazione del DNA, detectata con il TUNEL, e questi fenomeni è già stata dimostrata (Muratori et al. 2000). Tuttavia la positività al TUNEL è spesso considerata un segno di apoptosi spermatica, generando qualche confusione. Riuscendo meglio a comprendere il meccanismo di origine della frammentazione del DNA negli spermatozoi, sarebbe possibile disegnare nuove terapie per i pazienti subfertili e nuovi trattamenti per gli spermatozoi usati nelle ART. Tuttavia, ad oggi, le origini e le cause del fenomeno sono lontane dall’essere chiarificate, a dispetto della moltitudine di studi condotti nell’ultima decade. In letteratura, molte teorie sono nate circa l’origine della frammentazione del DNA. La prima teoria è originata da studi ottenuti in modelli di roditori (Mc Pherson et al., 1992 Sakkas et al., 1995) e poi confermata negli uomini (Marcon et al., 2004). Questi studi riportano che le rotture del DNA avvengono e poi vengono “ricucite” durante la spermiogenesi. L’enzima topoisomerasi 2 potrebbe intervenire nel ri-ligare le rotture nel DNA (Mc Pherson et al., 1993) e questi tagli transienti potrebbero avere un ruolo importante nel rimodellamento della cromatina, come suggerisce una coincidenza temporale tra la comparsa delle rotture e l’iperacetilazione dell’istone H4. Basandosi su queste osservazioni, la frammentazione del DNA degli spermatozoi presenti nell’eiaculato potrebbe essere interpretato come cellule che hanno fallito il processo di maturazione, in particolar modo il completamento del correttto impachettamento della cromatina. Alcune scoperte supportano questa teoria: 1) è stata riportata una stretta correlazione tra le rotture del DNA (Manicardi et al., 1998) e un impoverimento delle protamine e un aumento significativo della denaturazioe al DNA (un indice di scarsa stabilità  e resistenza della cromatina, Aravindan et al., 1997) e 2) lo spermtozoo con DNA frammentato spesso mostra persistenti residui citoplasmatici, evidenziati al microscopio elettronico (Muratori et al., 2000). Nel 1999 Sakkas ha riportato l’evidenza di alti livelli di espressione del recettore FAS nell’eiaculato, specialmente nei pazienti con parametri seminali anormali (Sakkas et al., 1999).In un gruppo di pazienti simili (Baccetti et al., 1996, Gandini et al., 2000), la presenza di strutture ultrastrutturali simili a quelle di cellule somatiche sono risultate ridotte previo trattamento con FSH. L’evidenza sia di segni evidenti ultrastrutturali di apoptosi che l’espressione del FAS negli spermatozoi di uomini subfertili, ha indotto Sakkas a ipotizzare che la presenza di spermatozoi con DNA frammentato nell’eiaculato umano può essere spiegato attraverso il fenomeno denominato “apoptosi abortiva”(Sakkas et al., 1999). L’apoptosi abortiva è un proceso apoptotico che comincia nel testicolo, ma che fallisce prima del completamento a causa di un errore nel programma di morte cellulare o nella spermatogenesi. Così le cellule commissionate alla morte non possono completare il loro processo e sono osservate nel seme insieme a spermatozoi anomali.  Nel periodo in cui l’”apoptosi abortiva” è stata proposta, si è cercato di dare un ordine e integrare molte delle scoperte fino a quel momento avvenute. Infatti, l’apoptosi è stata osservata sia nel testicolo umano che animale (Tapanainen et al., 1993, Rodriguez et al., 1997), dove sembra avere un ruolo importante nel bilanciare il numero di cellule germinali con le cellule di supporto del Sertoli (Sakkas et al., 1999) e per eliminare le celule danneggiate (Lue et al., 1999, Meistrich et al., 1993). In aggiunta, nello stesso periodo in cui è stata sviluppata questa teoria, le cellule germinali apoptotiche sono state studiate sotto l’aspetto dell’interazione tra il recettore FAS (espresso sulla superficie delle cellule germinali) e il FAS ligando (espresso dalle cellule del Sertoli)(Rodriguez et al., 1997, Lee et al., 1997), tuttavia, più recentemente, è stato dimostrato che questo può non essere il caso (D’Alessio et al., 2001, Hikim et al., 2003). Inoltre, molti studi hanno mostrato che l’apoptosi nell’epitelio seminifero è controllato da ormoni, in particolare l’FSH (Tapanainen et al., 1993, Billig et al., 1995), tantopiù che avviene una parziale riduzione di ultrastrutture simil-apoptotiche nell’eiaculato dei pazienti dopo un breve trattamento con questo ormone. Altri segni di apoptosi (come è stato trovato in cellule somatiche) è stato trovato nell’eiaculato di pazienti subfertili, tra cui l’espressione di marker apoptotici come p53 e Bcl-x e le caspasi (enzimi chiave dell’apoptosi, Weng et al., 2002).  Le caspasi sono membri della famiglia di proteasi acido aspartico dipendente da cisteina che coordina sia le caspasi iniziatrici (caspasi 8,9,10) o gli effettori (caspasi 3,6,7) dell’apoptosi (Cohen et al., 1997, Earnshaw et al., 1999). Entrambi i tipi di caspasi sono stati descritti nell’eiaculato umano (Weng et al., 2002). In aggiunta, recentemente sono stati trovati corpi circolari, senza cromatina, simili a corpi apoptotici somatici(Muratori et al., 2004). Questi corpi si colorano con la merocianina 540 (una probe che individua le cellule somatiche apoptotiche, Laakko et al., 2002) e sono presenti in alta percentuale nell’eiaculato di pazienti oligoastenoteratozoospermici, che è la stessa categoria di soggetti studiati da Sakkas, nei quali sono stati trovati alti livelli di FAS (Sakkas et al., 1999). Un altro marker di apoptosi delle cellule somatiche è la traslocazione della fosfatidilserina dallo strato interno allo strato esterno della membrana plasmatica. Molti articoli riportano l’importanza per la vita dello spermatozoo umano la non esposizione della PS sulla membrana, e quindi l’integrità di membrana (Weng et al., 2002, Moustafa et al., 2004, Shen et al., 2002). Questa scoperta è stata considerata come l’evidenza dell’apoptosi abortiva nelle cellule germinali. Tuttavia il significato dell’esternalizzazione della PS in spermatozoi vivi resta controversa. De Vries (De Vries et al., 2003) ha riportato che la traslocazione della PS è una modificazione fisiologica di membrana, che avviene durante la capacitazione, similmente nelle altre specie di mammiferi (Gadella et al., 2002). In aggiunta, è noto che l’esposizione della fosfatidilserina può indurre la produzione di ROS negli spermatozoi umani (Duru et al., 2000). Tuttavia, in contrasto con le cellule somatiche (Vinatier et al., 1996), l’azione nociva dei ROS sembra non attivare la via apoptotica nello spermatozoo, o almeno non agisce totalmente nell’attivazione delle caspasi (Grunewald et al., 2005, Taylor et al., 2004). Inoltre, Muratori e collaboratori hanno mostrato che, nonostante l’esposizione spontanea alla PS in spermatozoi vivi sia legata allo sviluppo della frammenazione in vitro del DNA, il meccanismo di frammentazione del DNA non appare implicato nell’attività di nucleasi (Muratori et al., 2003). Infatti, il trattamento con inibitori delle nucleasi, come per esempio l’acido auriltricarbossilico, sembra non prevenire lo sviluppo del danno al DNA in vitro. Anche se l’apoptosi abortiva attualmente sembra avvenire nel testicolo in alcune condizioni, non è univocamente dimostrato che sia la causa della frammentazione del DNA. Contemporaneamente alla scoperta della frammentazione del DNA e dei marker di apoptosi, è stato dimostrato che esiste solo una debole sovrapposizione tra le due. Inoltre non esiste alcuna correlazione tra le ultrastrutture simil-apoptotiche e il livello di frammentazione del DNA. Al contrario, i livelli di caspasi nello sperma sembrano essere sovrapponibili alla distribuzione del DNA frammentato. Infatti, l’espressione di questi enzimi è più alta nei pazienti subfertili rispetto ai donatori sani così come è più alta nella frazione spermatica immatura rispetto ai maturi. Studi sulla relazione tra le caspasi e la frammentazione nello sperma sono molto importanti da quando la degradazione apoptotica del DNA è dipendente dall’attivazione di molti tipi cellulari somatici (Said et al., 2004). Tuttavia una chiara correlazione causa-effetto tra l’attività delle caspasi e la frammentazione del DNA nello spermatozoo èlontana dall’essere dimostrata. Per il momento, Weng et al (2002) ha mostrato una correlazione positiva tra l’attivazione della caspasi 3 (il più importante esecutore) e il livello di frammentazione del DNA. Tuttavia, la percentuale di espressione dell’enzima a livello spermatico (più del 5%) risulta molto più basso rispetto ai livelli di frammentazione del DNA (più del 35%). Perciò, gli autori hanno concluso che la frammentazione del DNA è un processo indipendente dalla caspasi 3. In alternativa, essi proposero che vi era una dissociazione temporale tra l’attivazione delle caspasi e la frammentazione del DNA. Taylor et al (2004) hanno recentemente mostrato che l’attivazione delle caspasi non è associata ai marker dell’apoptosi (come per esempio l’esposizione della PS), suggerendo che, nell’eiaculato, le caspasi possono avere funzioni diverse dall’apoptosi.  Recentemente Sakkas (2004) ha proposto una modificazione alla teoria dell’apoptosi abortiva, in accordo alla quale, la mancanza di una netta associazione tra la frammentazione del DNA e i marker apoptotici (Muratori et al., 2000, Sakkas et al., 2002) nello sperma eiaculato può essere dovuta al fatto che, il danno al DNA e la persistenza di marker apoptotici sono generati in modo indipendente, anche se tramite processi correlati.  Le caratteristiche apoptotiche come per esempio l’espressione del recettore FAS, bcl-x e p53 trovate nell’eiaculato, possono significare un fallimento dell’apoptosi testicolare prima dell’intenso rimodellamento al nucleo e al citoplasma degli spermatidi (Sakkas et al., 2004). La presenza di tagli al DNA potrebbe essere  il risultato di un fallimento del normale processo di “ri-cucitura” che avviene durante il rimodellamento del nucleo nella spermiogenesi. Tuttavia, il rimodellamento nucleare e citoplasmatico può essere deviato dal normale corso di apoptosi e questo può far si che le cellule apoptotiche sfuggano alla loro eliminazione. In un altro caso, l’esecuzione del processo apoptotico potrebbe danneggiare la re-ligation dei tagli nel DNA. Il risultato potrebbe essere una popolazione etergenea nella quale, accanto alla popolazione cellulare normale, possono o non possono esserci cellule con marker apoptotici e tagli al DNA (Sakkas et al., 2004).  Un’altra causa si rottura del filamento di DNA proposta nell’eiaculato umano è lo stress ossidativo. Una grande varietà di fattori seminali sono conosciuti per la produzione di ROS, tra cui gli stessi spermatozoi (De Lamirande et al., 1999). Una piccola e regolata produzione di ROS da parte degli spermatozoi ha un ruolo fondamentale per il processo di capacitazione e la reazione acrosomiale. Tuttavia, un livello eccessivo di questi componenti aggressivi può essere responsabile del danno cellulare e, in particolare, del danno al DNA (De Lamirande et al., 1999, Aitken  et al., 2001). I radicali liberi sia esogeni (Lopes  et al., 1998) che endogeni (Twigg  et al., 1988) sono noti come aggressori al DNA spermatico. Alti livelli di ROS nel plasma seminale sono stati associati a scarsa qualità  del seme (Kodama et al., 1997, Aitken  et al., 1989) e pazienti infertili mostrano un aumento dei livelli di 8 idrossidesossiguanosina (un biomarker del danno ossidativo al DNA, Mazzilli et al., 1994). Inoltre è stata riportata una correlazione positiva tra i tagli nel DNA spermatico e la generazione spermatica di ROS (Barroso et al., 2000). Importanti studi in vivo hanno mostrato che un trattamento con antiossidanti diminuisce il danno al DNA spermatico (Agarwal et al., 2004).  La produzione eccessiva di ROS da parte dello spermatozoo è associata a una diminuzione del grado di maturità cellulare, in particolar modo al processo di riduzione del citoplasma che risulta anomalo, probabilmente causato dalla produzione di radicali liberi da parte di enzimi citosolici, come il glucosio-6-fosfato deidrogenasi e la NADPH ossidasi (Aitken et al., 2003).  In definitiva, l’immaturità è associata ad una morfologia anomala (Ollero et al., 2001, Gergely et al., 1999), che consiste in una correlazione negativa tra la frammentazione del DNA e la scarsa morfologia seminale (Lopes et al., 1998, Muratori et al., 2000). Una delle più significative differenze tra la teoria dei ROS e le altre, sta nel sito di origine della frammentazione del DNA. Sia la degradazione del DNA originata dall’apoptosi abortiva sia dal fallimento della ri-”cucitura” dei tagli del DNA originano nel testicolo, mentre il danno ossidativo al DNA origina nel testicolo così come nei siti post-testicolari. Muratori et al ha dimostrato che la frammentazione spontanea del DNA nello spermatozoo continua dopo l’eiaculazione(Muratori et al., 2003), indicando che la causa del fenomeno non è necessariamente localizzata nel testicolo. I dati fino ad ora raccolti, suggeriscono che la produzione endogena di ROS da parte degli spermatozoi è responsabile dello sviluppo de novo del danno al DNA (Muratori et al., 2003). In particolare, la scoperta che la frammentazione de novo deriva da anormalità spermatiche a livello morfologico), è in accordo con l’associazione tra anormalità morfologiche, immaturità e produzione eccessiva di ROS in queste cellule (Gomez et al., 1996, Ollero et al., 2001, Gergely et al., 1999). Interessante osservare che la frammentazione del DNA de novo nell’eiaculato non avviene in donatori sani (Lachaud et al., 2004).

POSSONO GLI SPERMATOZOI MATURI ANDARE INCONTRO ALL’APOPTOSI?

Sia lo stress ossidativo sia l’apoptosi abortiva sono teorie le quali cercano di spiegare l’origine della frammentazione del DNA spermatico nel seme, ma non dà alcuna informazione riguardo la possibilità che il fenomeno avvenga anche nello spermatozoo maturo. Quest’ultimo processo implica un differente sito di origine e differenti pathways di segnalazione e di esecuzione. Tuttavia non è ancora stato dimostrato che lo spermatozoo maturo è capace di originare la via apoptotica. Tuttavia, l’attività di nucleasi nello sperma di mammiferi tagliano la cromatina in frammenti pari a circa 50 kb (Sotolongo et al., 2005) e questo può indurre il meccanismo di apoptosi nello spermatozoo maturo. L’apoptosi è un meccanismo ubiquitario di morte cellulare in mammiferi. Molti esempi mostrano che il suo significato fisiologico è quello di eliminare le cellule danneggiate e regolare l’omeostasi dei tessuti senza provocare l’infiammazione. Quindi, è ragionevole pensare che un meccanismo simile intervenga per l’eliminazione, senza infiammazione, dopo la fertilizzazione di spermatozoi deposti nei tratti genitali femminili, quando uno degli spermatozoi ha fertilizzato l’oocita. Allo stesso modo, l’apoptosi di spermatozoi in siti post testicolari può rappresentare un modo per eliminare le cellule danneggiate e per regolare l’omeostasi del numero di spermatozoi nei tratti genitali maschili. 

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